一、准备工作

1. 仪器设备：CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2. 试剂耗材（以肠癌为例）： - 动物脑类器官培养基试剂盒（abs90050） - 基质胶（低因子、无酚红）（abs9495） - 60mm细胞培养皿（abs7005） - 100μm滤筛（abs7009） - 15mL离心管（abs7102） - 15mLEP管若干（abs7119） - 24孔细胞培养板（abs7035） - 金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

组分名称及规格： - 动物脑类器官培养基 A 100mL - 类器官原代培养缓冲液 B 250mL - 原代组织消化液 C 30mL - 类器官传代消化液 D 30mL - 组织保存液 E 100mL - 类器官冻存液 F 20mL - 类器官传代培养缓冲液 G 250mL。

二、操作流程

1. 样本准备

(1) 将组织放入含有预冷的（2-8°C）组织保存液E的取样瓶中（浸没整个组织），4℃从医院/实验室取回；

(2) 将取样瓶消毒，组织取出放入培养皿进行拍照，并登记大小、颜色、软硬程度、组织类型等信息。

2. 清洗-剪碎

(1) 在60mm细胞培养皿（abs7005）里用2-3mL原代培养缓冲液B浸泡，清洗三次后剪碎成大约1-3mm³的组织块，转移至15mL离心管。

3. 消化-过滤

(1) 向15mL离心管中加入5倍原代组织消化液C（消化液体积：组织体积=5:1），在37℃进行消化15-30min，观察消化情况；

(2) 取少量液体在显微镜下观察，观察到较多细胞团后，加入3倍体积原代培养缓冲液B终止消化，用枪头轻柔吹打使液体混浊；

(3) 使用100μm滤筛（abs7009）过滤，取少量滤液在显微镜下观察，并将滤液收集到15mL离心管中，300g、4℃富集离心5min后移去上清。

4. 加胶-点板-加液

(1) 准备工作：基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；枪头、离心管需-20℃预冷至少半小时；融化后的基质胶建议在2周内用完。

(2) 接种要求：24孔板（abs7035），每孔25μL基质胶细胞团混合物，500-750μL类器官培养液。

(3) 接种密度：建议1：基质胶体积：细胞团沉淀体积=25:1；建议2：500个细胞团/25μL基质胶；

(4) 向细胞团沉淀加入基质胶（abs9495），轻柔混匀后进行点板，操作要在金属冰盒或冰上完成。操作熟练后，要控制在半分钟内完成该环节，以保持基质胶良好的流畅性；

(5) 将培养板放入37℃培养箱中培养40-60min成胶，添加500-750μL类器官培养基A进行培养，10-14天后可以进行传代操作。

三、传代

1. 类器官数量较多或体积较大时的传代步骤

(1) 类器官收集及洗涤：移液器吸去培养基，加1-2mL 4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集在15mL离心管中；

(2) 洗涤：加入类器官传代培养缓冲液G使体积达到14mL，静置于4℃ 40min或-20℃ 5min，之后进行离心。

(3) 类器官消化和添加新基质胶，进行转移和培养。

四、冻存与复苏

1. 冻存要领

类器官在指数增长期进行冻存，通常在传代后的Day3-Day4，主要观察到的类器官直径在100um-200um。

2. 类器官冻存过程

根据密度要求，将适量类器官冻存液F与类器官轻柔混合后立即进行梯度冻存。

3. 复苏过程

将冻存管迅速解冻后，移入培养系统，添加类器官培养基进行培养，观察生长情况以便进行后续实验。

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