### 培养条件

使用DMEM培养基，添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素/链霉素（P/S），并确保细胞贴壁良好。培养温度设定为37℃。在初次传代时，推荐采取1:2的传代比例。建议同时购买相关产品，您可以享受非常优惠的价格。

收到细胞后，应立即进行处理，将其培养至良好状态。此时，将细胞培养瓶灌满完全培养液并密封是运输细胞的最佳方法。在进行细胞操作之前，使用75%的酒精喷洒整个细胞瓶，进行消毒。然后，将细胞瓶放入超净台内，保持严格的无菌操作。接着，将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，再进行进一步处理。

### 显微镜观察与照片记录

使用显微镜观察细胞生长情况，并保存不同倍数的照片（最好拍摄40x、100x和200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，如未提供照片，则默认为收到的细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

细胞传代：如果细胞连接率未超过80%，将瓶装完全培养液收集至离心管中，并保留5ml培养基，置于37℃、5% CO2孵箱中继续培养。如果细胞密度超过80%，则可进行传代。

贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%的胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，随后在显微镜下观察细胞消化情况。若大多数细胞变圆并脱落，迅速回到操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，再将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清，重悬并补加1-2ml完全培养基。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（即分配至两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

悬浮细胞传代步骤如下：

1. 采用半换液法，将培养瓶竖直静置1小时左右，轻轻吸掉约3ml的培养基后，再补充3ml完全培养基。如果培养基变色较慢，可直接添加约500µl的FBS。在传代时可补充5ml培养基，分至两个培养瓶中。通常经过3次传代后，可以进行一次离心以去除死细胞。
2. 如需分瓶，可以将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，添加1-2ml培养液后重悬混匀，并将细胞悬液按1:2比例分到新的T25瓶中，添加6-8ml新配置的完全培养基以保持细胞的生长活力。后续传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存：细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次；添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞变化，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打使其脱落，随后将悬液转移至15ml离心管中，进行1000RPM离心5分钟。记录下细胞沉淀后，弃上清，加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001）混匀后加入冻存管，最后直接放入-80℃冰箱中保存。如需转入液氮罐中，则需在-80℃保存24小时以上后再转入。

细胞复苏：取出细胞冻存管迅速放入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无结晶。然后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁。在15ml离心管中加入5ml完全培养基，随后将冻存管中的细胞转移进去，并以1000RPM离心5分钟。弃去上清后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶内，放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中进一步培养；第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

### 注意事项

部分细胞可能不够牢固，运输过程中易发生细胞脱落，这是正常现象。如果脱落较多，可以收集所有培养液至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养。之后，可以加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，进行1-2分钟消化，随后加入5ml完全培养基终止消化，再进行离心，重悬后按1:2比例分瓶培养。

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